Sposobnost uporabe eholokacije za navigacijo je bistvenega pomena za preživetje netopirjev. Pomaga jim leteti v temi in najti hrano, zlasti žuželke, tudi v popolni temi ali zapletenih okoljih, kot so jame. Z analizo odmevov njihovih klicev lahko netopirji določijo velikost, obliko, razdaljo, smer in hitrost predmetov v okolici.
Nekatere vrste netopirjev med letenjem oddajajo stalne visokofrekvenčne zvoke, druge pa proizvajajo kratke sunke zvoka. Ko zvočni valovi, ki jih oddajajo netopirji, zadenejo bližnje predmete, valovi odskočijo nazaj in dosežejo ušesa netopirjev, ki so zelo občutljivi na te frekvence. Netopirji nato uporabijo čas povratnih odmevov in razlike v nagibu ali intenzivnosti zvoka, da ustvarijo miselno podobo okolice.
Netopirji lahko natančno določijo razdaljo predmetov z merjenjem časa, ki je potreben, da se zvočni valovi odbijejo nazaj. Pogostost in trajanje vračanja odmeva jim pomagata tudi oceniti velikost in obliko predmetov v okolju. Nekatere vrste netopirjev lahko celo prepoznajo vrste žuželk, ki jih plenijo, z analizo odmevov, ki odbijajo s krila.
Sposobnosti eholokacije netopirjev so se razvile do visoke natančnosti, kar jim omogoča, da letijo skozi zapletena okolja in celo majhne vrzeli, ne da bi trčili z ovirami. Njihovi eholokacijski klici se lahko razlikujejo po frekvenci, hitrosti impulza in trajanja, odvisno od vrst netopirjev in njihovih posebnih prilagoditev različnim habitatom in lovskim strategijam.